博萊霉素 Zeocin 和 鹽酸博萊霉素兩種

該產(chǎn)品為Invitrogen原裝 整盒（8支*1.25ml） R25001

產(chǎn)品關(guān)鍵詞：

Zeocin 博萊霉素（博來霉素）；Phleomycin 腐草霉素；Sh ble基因；Streptomyces verticillus 輪枝鏈霉菌；Hygromycin B 潮霉素B；G418遺傳霉素；CAS NO.：11006-33-0

基本描述：

Zeocin?是博來霉素/腐草霉素（bleomycin/phleomycin）康生素家族的成員之一，從輪枝鏈霉菌Streptomyces verticillus中分離得到，對細西菌、珍菌（包括酵母菌）、植物和哺乳動物細胞具很強的毒性。來自Streptoalloteichus hindustanus的Sh ble基因賦予Zeocin抗性。

Zeocin?是腐草霉素D1的商業(yè)名稱，一種堿性、水溶性、銅離子螯合的糖肽康生素。銅離子的存在使得溶液為藍色，此銅螯合的形式為無活性。一旦進入細胞后，二價銅離子（Cu2+）被還原為一價銅離子（Cu+），并被細胞內(nèi)的巰基化合物去除。銅離子被去除后，Zeocin?被活化，嵌入DNA使其斷裂，樶終導致細胞死亡。

抗性基因：

Zeocin?抗性由編碼一種13,665Da大小蛋白的Sh ble基因（Streptoalloteichus hindustanus bleomycin gene）賦予，該蛋白化學計量方式結(jié)合Zeocin?，抑制其DNA雙鏈切割活性。因此，能表達此蛋白的真核和原核宿主細胞被賦予Zeocin?抗性。

基本特性：

1）CAS NO.：11006-33-0

2）化學式：C55H83N19O21S2Cu

3）分子量：1137.41 g/mol

4）外觀：藍色溶液（100mg/ml in deionized，autoclaved water）

5）運輸：冰袋運輸

6）保存：-30°C~-10°C，至少1年有效

7）大腸桿菌篩選：25-50μg/mL（低鹽LB培養(yǎng)基，NaCl濃度不能超過5g/L）

8）酵母菌篩選：50-300μg/mL（YPD或基本培養(yǎng)基）

9）哺乳動物細胞篩選：50-1000μg/mL（合適培養(yǎng)基，根據(jù)細胞系而不同）

注意事項：

1）Zeocin?對光敏感，需將康生素，或含該康生素的平板或培養(yǎng)基置于黑暗處。

2）降低西菌培養(yǎng)基的鹽濃度，調(diào)整pH到7.5使其保持活性，因高離子強度和酸或堿性都會抑制Zeocin?活性；

3）儲存Zeocin?在-30°C~-10°C，使用前需冰上融化。

4）Zeocin?有毒，為了您的按全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用方法（應(yīng)用舉例）：

1）大腸桿菌（E. Coli.）

宿主：不能包含Tn5轉(zhuǎn)座子（比如：Top10，DH5，DH10）

培養(yǎng)基：使用低鹽LB（10g Trypton，5g NaCl，5g Yeast extract），pH 7.5，防止Zeocin?失活

選擇濃度：25-50μg/mL用于大腸桿菌篩選

2）酵母菌（Yeast）

宿主：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）,畢赤酵母（Pichia pastoris）

培養(yǎng)基：含1M山梨醇的YPD（電轉(zhuǎn)化細胞）；YPD或基本培養(yǎng)基（化學轉(zhuǎn)化細胞）；測試培養(yǎng)基調(diào)pH到6.5-8.0，選擇pH值允許使用樶低濃度Zeocin?。

轉(zhuǎn)化方法：電轉(zhuǎn)法，使用鋰離子步驟或使用EasyComp試劑盒。不能使用原生質(zhì)體用于酵母轉(zhuǎn)化，因Zeocin?會引起完整細胞死亡。

選擇濃度：50-300μg/mL，取決于酵母菌類型、培養(yǎng)基pH和離子強度。建立殺滅曲線確定能殺死未轉(zhuǎn)化宿主細胞的樶低Zeocin?濃度。

3）哺乳動物細胞（Mammalian cells）

50-1000μg/mL用于篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系（平均常用濃度為250-400μg/mL）。取決于細胞系，需要2-6周用Zeocin?篩選得到穩(wěn)轉(zhuǎn)集落（foci）。進行穩(wěn)轉(zhuǎn)株正式篩選前，需確定能夠殺死所有未轉(zhuǎn)染宿主細胞的樶低Zeocin?濃度。

1） 確定細胞對Zeocin?的敏感性

2）篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系

篩選小技巧：若是細胞對Zeocin?耐性更強，可用含Zeocin?培養(yǎng)基進行細胞分盤，并置于37°C孵育2-3h，使得細胞貼壁。然后將細胞置于4°C，2h。記得使用Hepes作為培養(yǎng)基的緩沖體系。重新將細胞置于37°C孵育。4°C孵育細胞的目的是短時間內(nèi)終止細胞分化，使得Zeocin?能發(fā)揮作用，殺死細胞。

應(yīng)用圖片【Zeocin?篩選下的HEK293細胞】：

HEK293細胞用含10% FBS，1mM L-谷氨酰胺和400μg/mL雙抗的培養(yǎng)基，分別在添加和未添加400μg/mLZeocin?的培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)。

圖1，未經(jīng)Zeocin?篩選的HEK293細胞。

圖2，經(jīng)Zeocin?篩選3天后的HEK293細胞。隨著質(zhì)膜破裂，往細胞外延伸長出長臂（long appendages）。（見實心箭頭標注）

圖3，經(jīng)Zeocin?篩選3天后的HEK293細胞。細胞開始破裂，培養(yǎng)基內(nèi)發(fā)現(xiàn)細胞顆粒。（見空心箭頭標注）

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